碱基编辑安全性评估解决方案

碱基编辑安全性评估解决方案

1. 行业背景与监管要求

碱基编辑（Base Editing）技术是继CRISPR/Cas9之后基因治疗领域的重要突破。与传统核酸酶依赖的基因编辑不同，碱基编辑器通过将脱氨酶与失活或切刻型Cas9（nCas9）融合，能够在不产生双链断裂（DSB）的情况下，在基因组的精确位置实现单碱基的直接化学转化。目前主流的碱基编辑系统包括胞嘧啶碱基编辑器（Cytosine Base Editor, CBE）和腺嘌呤碱基编辑器（Adenine Base Editor, ABE）。CBE可将C·G碱基对转变为T·A，ABE可将A·T碱基对转变为G·C，覆盖了临床上超过60%的已知点突变致病位点，在遗传病治疗、肿瘤免疫细胞改造等领域展现出巨大的临床转化潜力。

然而，碱基编辑系统的脱靶效应具有独特的复杂性，给安全性评估带来了远超传统CRISPR工具的挑战。碱基编辑的脱靶效应可分为两大类：其一是sgRNA依赖型脱靶，由Cas9在基因组同源序列处的错配结合所引发，与传统CRISPR脱靶机制相似，具有可预测性；其二是非sgRNA依赖型脱靶，这是碱基编辑特有的风险——CBE和ABE中的脱氨酶结构域可随机结合单链DNA（如复制叉处暴露的基因组DNA）或RNA，造成基因组范围内的随机碱基转换和转录组水平的RNA编辑，这类脱靶无法通过序列同源性预测，是监管机构重点审查的安全隐患。

FDA 在《Human Gene Therapy Products Incorporating Human Genome Editing》（2024）以及《基因治疗产品非临床研究与评价技术指导原则（试行）》中明确要求基因编辑产品进行全面的脱靶风险评估，强调应采用多种方法进行基因组范围的分析以减少潜在脱靶位点识别中的偏差。我们采用多层次、多维度的综合检测策略，使用多个来源的供者样本以及设置科学的实验分组进行检测，该策略能够为基因编辑产品的临床前安全性评估提供充分的科学依据，确保IND申报材料符合监管要求并支持临床试验的顺利开展。

2. 行业痛点分析

碱基编辑产品的安全性评估在实际执行中面临多层次的技术与运营挑战。与传统CRISPR产品相比，其独特的双重脱靶机制使评估体系的构建更为复杂。

3. 全流程安全性评估解决方案

我们的碱基编辑安全性评估方案由三大核心技术平台支撑。首先是DNA水平脱靶检测平台，针对CBE和ABE的不同脱靶机制，分别采用软件预测、WGS、Detect-seq（CBE编辑）、lno-seq（ABE编辑）技术，实现对sgRNA依赖型和非sgRNA依赖型脱靶的全覆盖检测。其次是RNA水平脱靶检测平台，通过转录组测序（RNA-seq）专项分析流程，捕获碱基编辑器脱氨酶在转录组层面引发的随机RNA编辑事件，弥补DNA检测的盲区。最后是脱靶位点验证平台，结合液相杂交捕获测序（TES）与扩增子深度测序逐级验证，对候选脱靶位点进行高灵敏度定量验证，形成符合监管要求的完整证据链。

3.1 整体技术路线图

图1. 碱基编辑安全性评估全流程技术路线图

3.2 核心服务模块详解

模块一：专用软件预测

软件预测是脱靶评估的第一步，也是实验检测的重要前置环节。与通用CRISPR预测工具不同，我们针对CBE和ABE分别采用专属的深度学习预测模型（CBEdeepoff / ABEdeepoff），综合考量序列错配、碱基编辑偏好及染色质可及性等因素，在全基因组范围内对sgRNA依赖型脱靶位点进行风险评级，输出候选位点列表。

模块二：100xWGS脱靶检测

WGS能够无偏倚地扫描整个基因组，是监管机构要求的脱靶评估基础方法之一。需要指出的是，WGS本身的检测灵敏度有限，无法单独作为碱基编辑脱靶评估的充分手段，必须与Detect-seq、Ino-seq等高灵敏度专属检测方法联合使用，方能满足FDA和CDE对多维度正交验证的监管要求。

我们采用≥100X深度对编辑组与对照组样本同步建库测序，经质控过滤后，采用GATK + Freebayes + VarScan三工具联合calling取交集，最大限度排除假阳性。随后叠加BE特异性过滤，从全部SNV中提取CBE特征变异（C→T/G→A）或ABE特征变异（A→G/T→G），根据变异位点是否位于sgRNA同源序列附近，将结果分类为sgRNA依赖型和sgRNA非依赖型脱靶，输出高可信度脱靶位点列表，与后续专属检测方法的结果进行整合分析。

模块三：碱基编辑专项脱靶检测

（1）Detect-seq检测（CBE编辑）

Detect-seq的核心原理是特异性捕获CBE编辑中间体脱氧尿苷（dU）。流程分三步：①捕获中间产物——通过特异性标记dU并富集含dU的DNA片段；②信号放大——dU附近的正常胞嘧啶被替换为5-醛基胞嘧啶（d5fC），经化学标记转为T，测序时在编辑位点前后约150bp范围内呈现以dU为中心的连续C→T突变信号，与背景噪声形成清晰区分；③精准定位——基于连续C→T特征信号结合生信分析，定位CBE脱靶位点，可覆盖sgRNA依赖型、非依赖型、sgRNA结合区域外编辑及靶向链编辑等全类型脱靶。

（2）Ino-seq检测（ABE编辑）

Ino-seq通过追踪ABE产生的脱氧肌苷（deoxyinosine, dI）实现全基因组范围内的脱靶检测。该方法的核心原理基于核酸内切酶V（EndoV）的特异性：EndoV能够识别肌苷并在其3'端第二个磷酸二酯键处精确切割DNA。

具体流程如下：①细胞经ABE处理后提取基因组DNA并进行机械打断；②片段末端连接接头，经损伤修复和外切酶处理去除没有加上接头的DNA片段；EndoV在含肌苷位点特异性引入切口；③热变性后，单链DNA结合蛋白（SSB）稳定单链结构，被切开的单链不带生物素，通过链霉亲和素磁珠去除未被切割的DNA片段，从而富集含肌苷的DNA；④连接带独特分子标签（UMI）的桥式接头后进行PCR扩增，完成文库构建；⑤测序时，肌苷位点固定位于P7测序引物下游第2个碱基。

模块四：转录组脱靶检测

通过全转录组测序（RNA-seq）技术检测单碱基编辑器在转录组层面引发的脱靶编辑事件。具体分析流程为：首先对RNA样本进行高通量测序，获得转录组数据；随后通过严格的生物信息学分析流程，包括序列质控、比对到参考基因组、识别碱基变异位点、过滤SNP等背景变异，最终鉴定出真实的RNA编辑位点。分析过程中区分Alu重复区和非重复区的编辑事件，并对12种碱基编辑类型（如A-to-G、C-to-U等）进行全面统计和注释，从而在全转录组水平上捕获碱基编辑器脱氨酶引起的随机RNA编辑事件，实现对RNA脱靶效应的无偏检测和定量评估。

模块五：脱靶位点验证

以前期检测所得候选脱靶位点为输入，针对每个位点定制设计探针并合成。实验流程为：片段化后基因组DNA经dA加尾后连接含UMI（唯一分子标识符）的双端接头（UMI-L/UMI-R），PCR扩增后与靶向脱靶位点的探针进行液相杂交，经链霉亲和素磁珠捕获、洗涤及PCR扩增，完成靶向深度测序与数据分析。引入UMI可在生信分析阶段对PCR重复进行精确去除，有效消除PCR扩增偏好性导致的假阳性，提别显著提升单碱基低频脱靶事件的检测准确性。

对于CBE，输入位点来源于CBEdeepoff预测、WGS及Detect-seq三层检测所筛查的候选位点（sgRNA依赖型脱靶+sgRNA非依赖型脱靶位点），探针设计覆盖相应C→T编辑窗口区域，重点验证胞嘧啶编辑事件；对于ABE，输入位点来源于ABEdeepoff预测、WGS及Ino-seq三层检测所筛查的候选位点，探针设计覆盖相应A→G编辑窗口区域，重点验证腺嘌呤编辑事件。两者均可在单次实验中同时覆盖数百个候选位点，实现高通量初步筛查。

图注：UMI液相杂交捕获脱靶检测原理图

4. 服务模式

5. 客户价值

我们的优势

• 全链条技术覆盖：国内少数同时具备CBE与ABE专属脱靶检测（Detect-seq/Ino-seq）、全基因组测序、转录组RNA脱靶检测及多种验证方法全流程服务能力的企业，极大降低客户的供应商管理和沟通成本。采用标准化的ISO9001/CNAS认证流程，确保检测结果的准确性和可靠性，满足FDA和CDE的最新监管要求。

• 专属技术平台：针对碱基编辑器的独特脱靶机制，自主建立Detect-seq（CBE专用）和Ino-seq（ABE专用）检测平台，相较于通用脱靶检测方法，可更全面覆盖sgRNA依赖型、非依赖型、protospacer外编辑及靶向链编辑等全类型脱靶，同时配套RNA水平脱靶检测，构建DNA+RNA双维度安全性评估体系。

• 丰富的CGT行业经验：已成功服务多家头部CGT企业，深度理解碱基编辑产品IND申报的监管要求和技术难点，能够提供专业的检测方案设计、数据解读和监管策略建议。我们不仅提供检测数据，更提供符合监管要求的完整申报材料包，助力客户顺利通过IND审评。

• 灵活的服务模式：支持IND申报全流程打包与单项服务，可根据客户的具体需求和预算提供定制化方案。配备专属项目经理全程跟踪，快速响应客户需求，确保项目高效推进和按时交付。

6. 参考文献

(1)《Human Gene Therapy Products Incorporating Human Genome Editing》2024

(2)《体内基因治疗产品药学研究与评价技术指导原则（试行）》2022

(3)《基因治疗产品非临床研究与评价技术指导原则 （试行）》2021

(4)   Lei, Z., Meng, H., Lv, Z. et al. Detect-seq reveals out-of-protospacer editing and targetstrand editing by cytosine base editors. Nat Methods 18, 643–651 (2021). https://doi.org/10.1038/s41592-021-01172-w